C’est quoi la culture cellulaire ?
On appelle culture d’organe, le maintien en dehors de l’organisme, d’organes ayant conservé leur structure et leur fonction (coeur perfusé). On appelle culture de tissu, le maintien en dehors de l’organisme, des tissus de manière à conserver les fonctions spécifiques de chaque tissu. On appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l’organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d’exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.
Histoire : 3 périodes vont marquer le développement de la culture cellulaire.
La période des précurseurs (1885, 1900). Cette période annonce la première méthode de culture de tissu en dehors du corps, grace au Professeur Ross Harrison qui a pu cultiver des neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la recherche actuelle sur les cellules souches et dérivées. La période de la culture de tissus (à partir de 1902). Cette période est dominée par Alexis Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant 3 voies principales:
- L’amélioration des techniques d’obtention des tissus.
- L’élaboration des règles d’aseptie.
- L’étude des besoins nutritionnels.
Les techniques d’obtention des cellules:
- Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang
- Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.
Les techniques d’obtention de ces 2 classes de cellules sont différentes.
- Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.
- Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en oeuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique.
La méthode par dissection : Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d’obtenir les premières cellules in-vitro. La méthode de Carrel consiste à prélever un morceau de tissu qui est réduit en un très petit rectangle et déposé à la surface d’un mélange de 2 gouttes de plasma de coq et de 2 gouttes d’extrait embryonnaire à 50%. Après un séjour de 24H à l’étuve, on voit migrer les premières cellules à partir de l’explant. La méthode de dissection consiste à couper en fragment d’environ 1 à 4 mm3 le tissu que l’on réduit encore à l’aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif. Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s’appelle également la méthode des explants.
La méthode mécanique:
La méthode par digestion enzymatique : Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline.
Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.
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La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L’obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).
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La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.
Les méthodes de culture:
La culture stationnaire ou monocouche : Le principe général de cette méthode est lié à l’affinité des cellules au support car la plupart appartient à des tissus solides organisés. Le support peut être du verre ou du plastique traité pour la culture. Le plastique peut être recouvert de support physiologique: collagène, fibronectine ou d’une membrane basale reconstituée ou encore l’utilisation de gèle d’agarose, de géle de collagène pour une orientation vers la culture 3D.
La culture en suspension : Comme la plupart des cellules ont besoin d’un support pour croître, il faut donc trouver un artifice pour maintenir la plupart de celles-ci en suspension.
En 1933, Monsieur Gey arrive à faire croître dans des tubes en verres, des cellules en suspension tournant à grande vitesse.
L’agitation peut être réalisée par différents moyens :
- Elle peut être entretenue par des barreaux magnétiques siliconés appelés « SPINNER »
- Il existe également des appareils d’agitation perfectionnés appelés des cytoculteurs qui permettent de maintenir une densité cellulaire,un environnement gazeux constant ainsi qu’un apport continu de milieux frais et la récupération de milieux usés.
Contrôles fonctionnels des cellules en culture :
Deux caractéristiques sont à considérer :
- La prolifération des cellules.
- La préservation des fonctions spécialisées.
Les contrôles réalisés lors de la mise en route d’une culture : On vérifie les conditions s’aseptie lors de la dissection et augmente la dose d’antibiotique et fongique si nécessaire.
On vérifie l’état des cellules recueillies par le bleu de trypan. Le bleu de trypan est un colorant qui a tendance à entrer dans les cellules qu’il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue. Cependant, cette molécule étant toxique, elle finit par tuer les cellules qui deviennent alors toutes bleues. On vérifie la morphologie des cellules au microscope et la présence d’un marqueur biochimique spécifique du type cellulaire.
