La CHROMATOGRAPHIE (2.0) suite
La chromatographie d’affinité:
Principe:
Quand une solution protéique non purifiée traverse la colonne, la protéine désirée se lie à l’effecteur, tandis que les autres composants sont élués. La récupération de la protéine désirée est ensuite obtenue par des modifications de la phase mobile. Ces modifications concernent le tampon pH, le tampon de force ionique ou l’ajout d’un compétiteur:
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le tampon pH différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de l’état d’ionisation de celle-ci provoquant sa désorption.
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le tampon de force ionique différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de la conformation de la protéine.
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l’ajout d’un compétiteur (effecteur libre).
L’effecteur:
Selon le type de molécule fixée sur le support, on peut distinguer 3 types d’affinités:
- l’utilisation comme effecteur un substrat, permet d’entreprendre une sélection d’enzyme.
- l’utilisation comme effecteur un ligand, permet d’entreprendre une sélection de recepteur.
- l’utilisation comme effecteur un anticorps, permet d’entreprendre une sélection d’antigène.
La fixation de l’effecteur sur le support d’agarose:
Les groupes hydroxyles (OH) du support d’agarose réagissent avec le bromure de cyanogène pour donner un intermédiaire « activé » et stable (cette manipulation ce réalise à l’aide d’une solution dont le pH est finement contrôlé (pH8,3)), ainsi des groupements imidocarbonate se forment permettant la fixation de l’effecteur contenant des amines libres.
Beaucoup de protéines sont incapables de se fixer à leurs effecteurs couplés au bromure de cyanogène, a cause d’interférences stériques d’où un problème d’accessibilité avec la matrice d’agarose. On utilise dans ce cas là, un bras espaceur qui se place entre le support et l’effecteur.
Avantage:
La chromatographie d’affinité est la méthode la plus sélective.
Inconvénients:
La chromatographie d’affinité est une méthode coûteuse et délicate à mettre en oeuvre:
– la fixation de l’effecteur à la matrice ne doit pas (ou peu) modifier l’affinité de celui-ci vis à vis de la macromolécule cible.
– l’affinité effecteur-macromolécule doit être suffisamment forte pour permettre la fixation, mais pas trop pour que l’on puisse, ensuite, dissocier la liaison et éluer la protéine sans la dénaturer.
– dans le cas d’un isolement d’une enzyme, il est important de veiller à ce que les conditions chromatograhiques ne permettent pas à cette enzyme d’être fonctionnelle, risquant ainsi de transformer l’effecteur.La chromatographie d’échange d’ions:
Histoire:
Grâce à cette méthode, lls ont pu déterminer le site actif de la Ribonucléase bien avant que l’on puisse établir sa structure tridimentionnelle. Ils ont ainsi montré que ce site était constitué de 2 résidus spécifiques de l’histidine.
Principe:
Cette méthode repose sur la différence d’interraction entre les molécules chargées à séparer et la phase stationnaire.
La phase stationnaire:
La phase stationnaire est constituée d’un support macromoléculaire chimique comme le dextrane, la cellulose ou le gel de polyacrylamide sur lequel sont greffés par liaison covalente des groupements soient acides, susceptibles de se charger négativement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est supérieur à leur pKa . Il s’agit alors d’échangeur de cations.
Soient basiques, susceptibles de se charger positivement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est inférieur à leur pKa. Il s’agit alors d’échangeur d’anions.
Notons que les groupements d’acide ou de base forte sont ionisés quel que soit le pH de la solution tampon.
Exemple de groupement d’acide faible: le carboxyméthyl au pKa de 4.
Exemple de groupement de base faible: le diethylaminoéthylammonium au pKa de 9,5.
Exemple de groupement d’acide fort: La résine sulfonique.
Exemple de groupement de base forte: l’ammonium quaternaire
L’affinité d’un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs:
• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :
– de leur nature (pKa)
– du pH de la solution
• de la densité de charge de l’ion considéré, qui dépend:
– de la charge de cet ion c’est-à-dire :
– de la nature de l’ion (pKa, pHi)
– du pH de la solution
– de la taille de l’ion (un ion est d’autant plus fixé qu’il est chargé, ou/et qu’il est petit)
• de la concentration des ions
• de l’accessibilité des groupements fonctionnels
La chromatographie d’échange d’ions se réalisent en 4 étapes:
Première étape: la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l’échangeur d’ions soit ionisé.
Deuxième étape: dépot des molécules à séparer sur la colonne. La solution est dans le même tampon de pH qui a permis de ioniser l’échangeur d’ions.
Troisième étape: élution des molécules fixées sur la résine soit en modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu’elles portent une charge de même signe que l’échangeur d’ions). Il n’y a plus alors d’interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine. Soit, en ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine: cet ion s’appelle un contre-ion.
L’ ordre d’efficacité croissant des contre – ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant:
- cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
- cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+
- de plus, l’efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+
Exemple de contre-ions pour les résines échangeuses d’anions:
Cl- ; HO-
Quatrième étape: régénération de l’échangeur d’ions ( par lavage extensif avec une solution de pH premettant de remettre les charges dans leur valeur initiale).
Les applications de la chromatographie d’échange d’ions :
Quelques exemples d’application :
- l’analyse des eaux usées, des eaux de surface et souterraines
- la caractérisation de solutions du sol et d’extraits de litières
- le dosage des anions adsorbés sur la surface des minéraux du sol, en vue de caractériser leur propriétés de charge de surface et leur affinité sélective pour certains ions
- l’analyse des gaz et eaux d’origine volcanique
